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　　威尼德分子杂交仪：Western blot常见试验问题归纳与总结 威尼德生物科技（北京）,研发生产的经济型分子杂交仪VH-1000、 多功能型分子杂交仪VH-4000、组合型分子杂交仪VH-2000,底部标配培养皿圆 周运动托盘，选配250ML/500ML锥形瓶托盘，96孔酶标板托盘，可适用于如 放置杂交袋等其他严格要求的孵育实验一以及膜洗脱和凝胶脱色，同时可以做 恒温微生物培养。分子杂交仪是现代实验室采用杂交技术的理想设备，可替代塑 料杂交袋和水浴摇床，并防止破损带来的污染危害。 QI: PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？ A1:一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联,假设反复洗几次后， 蛋白容易掉下来，效果较差。尼龙膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合（注: 常用的PVDF膜即带正电荷的尼龙膜），同时也有疏水作用，但相对较弱。这样 的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，效果较好。 Q2:做组织样品的western blot的时候，处理样品有什么诀窍？ A2:必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋 白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提（超速离心）。还有一 点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入PMSF和蛋 白酶抑制剂），封闭剂一般5%脱脂奶粉。如果一抗为多克隆抗体，使用BSA也 是不错的选择Q3:免疫组化和 Western blot可以用同一种抗体吗？ A3:免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表 位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮 后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果 你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗 体可同时用于免疫组化和Western blotting,而如果抗体识别构象形表位，那么只能 用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。（限于 单抗） Q4:不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决？ A4:可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）（优化的转移缓冲液， 可以参考《蛋白质技术手册》），因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋 白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延 长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.l%SDS,也是为了增加转移效率；用优 质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶, 如低至6%。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压/电流；增加转移时 间。 威尼德生物科技（北京）,研发生产的经济型分子杂交仪VH-1000、 多功能型分子杂交仪VH-4000、组合型分子杂交仪VH-2000,底部标配培养皿圆 周运动托盘，选配250ML/500ML锥形瓶托盘，96孔酶标板托盘，可适用于如 放置杂交袋等其他严格要求的孵育实验一以及膜洗脱和凝胶脱色，同时可以做 恒温微生物培养。分子杂交仪是现代实验室采用杂交技术的理想设备，可替代塑 料杂交袋和水浴摇床，并防止破损带来的污染危害。 Q5:Western blot哪种染色好？ A5:（l）阴离子染料是最常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达 到1.5解，考马斯亮蓝虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春 红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去，以便进行随后的氨基酸分析。缺点是: 溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的皱缩或破坏，不能用于带正电荷的膜。灵 敏度低。 （2）胶体金，灵敏度高，检测范围可到pg级，但染色比拟稳定。 （3）生物素化灵敏度位于1、2之间，可用于任何一种膜。 。6:用Western检测基因转染后细胞培养上清中表达的目的蛋白（定性）, 分子量为20KD,浓度约为几百iiRml。蛋白样品是否需浓缩、纯化？如何浓缩、 纯化上清液中的目的蛋白？对小分子蛋白Western blot时需特别注意哪些条件？ A6：按照提供的浓度，如果做Western blot,是不用浓缩样品的.对于20kd的小 分子的蛋白，Western Blot中要注意的是： 转移时的时间，转移时的电流或电压. transfer buffer 中加 20%的甲醇. 可以用13-15%的别离胶. Q7:半干法转移与胶的面积和蛋白分子两大小有一定关系、那么湿法转移 是不是所有的转移条件都一样呢？ 一般的条件是怎样的？ A7：半干转的电流大小是按照面积来算的，时间是根据蛋白分子大小定的；而 湿转的话电流是恒定的，时间也是根据分子量而定。 Q8:采用生物素标记的二抗.SABCDAB检测系统做western,非特异性的条带和背景很高，总蛋白考染的时候发现接近积层胶的条带比拟清楚，条带也 很窄，可是越靠下面的条带越来越宽，有的跑得都连在一起，这是什么原因， 如何解决？ SDS—PAGE的时候恒压和恒流哪个好？ A8：非特异性的条带和背景高：可能性很多，如一抗，二抗，封闭的原因都可 能。总蛋白考染的时候发现接近积层胶的条带比拟清楚，条带也很窄，可是越靠 下面的条带越来越宽，有的跑得都连在一起，这种现象是正常的。另外，也可能 积层胶有问题。SDS—PAGE的时候，恒压和恒流都可以用。 威尼德生物科技（北京）,研发生产的经济型分子杂交仪VH-1000、 多功能型分子杂交仪VH-4000、组合型分子杂交仪VH-2000,底部标配培养皿圆 周运动托盘，选配250ML/500ML锥形瓶托盘，96孔酶标板托盘，可适用于如 放置杂交袋等其他严格要求的孵育实验一以及膜洗脱和凝胶脱色，同时可以做 恒温微生物培养。分子杂交仪是现代实验室采用杂交技术的理想设备，可替代塑 料杂交袋和水浴摇床，并防止破损带来的污染危害。 VH-2000 VH-2000 -、 g △ 。9:血清样品进行 Western blot分析，目的蛋白21kD,结果显色出来后, 目的条带很淡，而白蛋白和及G条带很浓，为什么？ A9：可能是因为白蛋白为67kD和目的蛋白相差较大，且其浓度较低，可以底物二氨基联苯胺和0.01%过氧化氢溶液显色的时间延长为30分钟，再用去离子水 漂洗以终止反响；也可能是抗体的特异性不好。把封闭的时间延长，同时提高封 闭液的浓度，可以减少以下背景噪音。同时洗的时候要彻底，而目的条带弱，说 明浓度缺乏，如果不考虑后续功能的线 （细）柱子，纯化靶蛋白, 接着真空冷冻浓缩，可以得到很好的结果。 Western转膜已经成功了，但是Marker泳道未见蛋白条带，其余各泳道均有清晰的蛋白条带，经考马斯亮蓝染胶，结果相同。经5%的脱脂牛奶封闭 1小时45分钟后，进行一抗孵育（1： 200,建议起始浓度）过夜，二抗孵育5个半小时（1:2000）,均在室温下，DAB显色，虽出现蛋白条带，但较弱，且出